透皮傳遞能將藥物直接輸送到血液中，有效克服口服、注射等傳統(tǒng)給藥方式的弊端，從而成為藥物傳遞的一種重要方式。大多數(shù)藥物并不具備強透皮能力，借助載體透皮成為主要的藥物輸送方式，因此具有透皮傳導(dǎo)能力的透皮介導(dǎo)肽展示出了廣闊的應(yīng)用前景。

       根據(jù)來源不同，透皮介導(dǎo)肽可分為 3類：蛋白質(zhì)來源的透皮介導(dǎo)肽、基因重組來源的 透皮介導(dǎo)肽和人工設(shè)計合成的透皮介導(dǎo)肽。

       1、蛋白質(zhì)來源的透皮介導(dǎo)肽

       蛋白質(zhì)來源的透皮介導(dǎo)肽是由天然蛋白質(zhì)或其片段衍生而來的短肽，這些肽具有獨特的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)特性，使其能夠穿透細(xì)胞膜，而且通常具有較低的免疫原性，不易引起免疫反應(yīng)。

       ①TAT-PTD是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞穿膜肽。研究發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的TAT蛋白可以被細(xì)胞跨膜攝取并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。自然界中這類天然存在的多肽能夠安全有效地實現(xiàn)外源生物大分子的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，被稱為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PTD）家族。TAT中含有一個與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能密切相關(guān)的多肽片段（富含堿性氨基酸且?guī)д姾桑?，進一步研究證實，TAT中第47～57位的11個氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR）可獨立穿過多種類型的細(xì)胞膜，穿膜效率比全長TAT還要高，于是此段肽鏈被歸為TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（TAT-PTD）。TAT-PTD可遞送雙氯芬酸鈉、熱休克蛋白P20、人類酪氨酸酶質(zhì)粒、鹽酸利多卡因（LID）、降鈣素和塞來昔布等藥物進入皮膚，并發(fā)揮良好的治療作用。

       ②來源于果蠅觸角蛋白異型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白ANTP也是經(jīng)典的細(xì)胞穿膜肽之一，ANTP由60個氨基酸序列組成，包含3個α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中第3螺旋結(jié)構(gòu)中的16個氨基酸多肽片段（43～58位）在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，目前，ANTP已實現(xiàn)商品化，即Penetratin。Penetratin可有效增強卵清蛋白（OVA257～264、OVA8）的穿透皮膚表面能力，從而引發(fā)高水平的OVA 特異性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。Penetratin 修飾的微乳能顯著增加紫杉醇活性表皮層和真皮層的沉積量。

       除了廣泛應(yīng)用的TAT-PTD和ANTP等細(xì)胞穿透肽，其它的一些來自于生物體的細(xì)胞穿透肽也被發(fā)現(xiàn)具有透皮能力。低分子量魚精蛋白（LWMP）是天然魚精蛋白通過酶消化產(chǎn)生的肽片段。LWMP成本低、易于批量生產(chǎn)，是目前研究比較廣泛的細(xì)胞穿膜肽。LMWP 與 TAT-PTD 具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性，其結(jié)構(gòu)也有10個精氨酸殘基，與TAT-PTD 的促滲機制也相似。LMWP與卵清蛋白結(jié)合后，可以顯著提高卵清蛋白穿透皮膚的能力。LMWP 修飾的聚乙烯亞胺/DNA 復(fù)合物（PEI/DNA）納米粒的皮膚累積透過量明顯優(yōu)于未修飾的 PEI/DNA納米粒。此外，從家蠶的 30kc19蛋白中發(fā)現(xiàn)的 Pep-c19，人源蛋白中得到的 IMT-P8和來源于非洲爪蟾皮膚的蛙皮素，人類蛋白磷酸酶中發(fā)現(xiàn)的 Mgpe-9，從人類轉(zhuǎn)錄因子中鑒別出的Hph-1-PTD等蛋白質(zhì)來源的細(xì)胞穿膜肽同樣具有促進透皮吸收的作用。

       2、基因重組來源的透皮介導(dǎo)肽

       蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（PDT）為開發(fā)新型透皮介導(dǎo)肽提供了一種高效手段。它將外源肽的編碼基因插入噬菌體（通常是M13、T4或 T7噬菌體）的外殼蛋白基因中，構(gòu)建噬菌體展示文庫。噬菌體展示文庫可以包含大量不同的肽序列，增加篩選成功的可能性。基于PDT發(fā)現(xiàn)的透皮介導(dǎo)肽主要通過“生物淘洗法”得到。通常其流程是先將噬菌體顆粒應(yīng)用到活體/離體皮膚上，再收集、擴增可以穿透皮膚的噬菌體，將這些可以穿透皮膚的噬菌體再次應(yīng)用到皮膚上。經(jīng)過幾輪篩選后，通過穿透噬菌體的基因組 DNA 測序，鑒定可以持續(xù)穿透進入皮膚的肽序列。經(jīng)篩選鑒定的肽通過透皮實驗進一步評價其促滲效果。其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在，可從數(shù)以億計的氨基酸序列中篩選出目標(biāo)肽透皮介導(dǎo)肽，實現(xiàn)高通量篩選。但是，找到高效穿透皮膚屏障的肽序列可能需要多輪篩選和優(yōu)化，過程耗時較長。篩選得到的肽序列通常生物相容性較好，但在實際應(yīng)用中仍需評估其潛在的免疫原性和毒性。

       ①TD-1（ACSSSPSKHCG）是利用體內(nèi)PDT篩選得到的具有11個氨基酸由二硫鍵成環(huán)的短肽，是第一個被報道能通過經(jīng)皮給藥途徑有效攜帶蛋白質(zhì)藥物（胰島素）的透皮介導(dǎo)肽。TD-1具有序列特異性和濃度依賴性，缺失其中的某些氨基酸都會降低透皮速率，并且隨著 TD-1濃度的升高，透皮增強效果也隨之提高。

       ②SPACE肽和DLP是使用離體豬皮進行 PDT篩選所得，其可以同時增強大分子穿透表皮和真皮細(xì)胞膜活性。研究表明，這2個多肽在人體皮膚、小鼠皮膚、豬皮上均可實現(xiàn)高效穿透，其中關(guān)于SPACE肽研究開展的更加廣泛，例如 siRNA、環(huán)孢素A、透明質(zhì)酸等的遞送。

       此外，線性肽T2（LVGVFH）和七肽 DRTTLTN均能發(fā)揮促滲作用。

       3、人工設(shè)計合成的透皮介導(dǎo)肽

       人工設(shè)計合成的透皮介導(dǎo)肽是根據(jù)天然蛋白質(zhì)和基因重組來源透皮介導(dǎo)肽的特點設(shè)計得到的新透皮介導(dǎo)肽。該方法不受限于天然肽或蛋白質(zhì)的序列，可以探索新的序列組合和功能，提高創(chuàng)新性。較早發(fā)現(xiàn)的天然來源細(xì)胞穿膜肽（如 TAT、ANTP）的一個典型特征是其中含有高濃度的精氨酸或者其他堿性帶正電的氨基酸。聚精氨酸（Rn）在進入細(xì)胞時比賴氨酸、鳥氨酸或組氨酸組成的類似長度聚合物更有效，這表明精氨酸在穿透細(xì)胞膜過程中起著重要的作用。

       ①聚精氨酸（R7）應(yīng)用到皮膚滲透研究中，可以提高環(huán)孢素A的跨皮膚轉(zhuǎn)運。聚精氨酸的皮膚滲透深度取決于施用精氨酸的數(shù)量和濃度。比較不同數(shù)量精氨酸的序列增強納米脂質(zhì)載體促進皮膚滲透的能力發(fā)現(xiàn)，精氨酸數(shù)量從8增加到11時，皮膚滲透能力增強；精氨酸數(shù)量從1增加到15時，皮膚滲透能力降低，這被歸因于精氨酸的長度導(dǎo)致的飽和效應(yīng)或空間位阻。不過，不同藥物可能需要不同長度的聚精氨酸。例如，R4顯著提高三肽-1（甘氨酰-組氨酰-賴氨酸，GHK）的滲透率；R6連接免疫蛋白OVA 應(yīng)用到雄性小鼠皮膚上，增強了抗原特異性抗體的誘導(dǎo)；TD-1與R8聯(lián)用可促進 MITF-siRNA 皮膚滲透，顯著抑制黑色素合成；R9 可提高綠色熒光蛋白（GFP）和胰島素的皮膚滲透；R11 修飾的塞來昔布納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體比未修飾載體有更高的透皮效率。此外，還有一些含有精氨酸殘基的肽具有皮膚促滲作用，如 R5H3、R8H3等。

       ②利用賴氨酸雙取代TD-1的N-5和N-6位得到的TD-34（ACSSKKSKHCG）顯示出良好的促滲活性。由于透皮介導(dǎo)肽容易被蛋白水解酶降解，近年來開發(fā)了多種增強透皮介導(dǎo)肽穩(wěn)定性的方法。其中最穩(wěn)定和可靠的方法是N-乙?；虲-酰胺化。TDN（ACSSKKSKHCG-NH2）是在TD-1的 C末端酰胺化修飾獲得的，TDN 的穩(wěn)定性明顯高于TD-1。將TD-34的 N-1和N-2氨基酸進行取代，且C末端進行酰胺化，合成線性肽DL-2（KWSSKKSKHCG-NH2）和環(huán)狀肽DLCC-2（KCSSKKSKHCG-NH2）在皮膚中能維持相對穩(wěn)定的有效透皮介導(dǎo)肽濃度，促進藥物的皮膚吸收。

       ③Pep-1是利用細(xì)胞穿膜肽的兩親特性設(shè)計的嵌合肽，該肽可將各種多肽和蛋白質(zhì)以完全生物活性的形式有效地輸送到幾個細(xì)胞系中，無需與載荷蛋白進行化學(xué)共價連接或使載荷蛋白發(fā)生變性。Pep-1由富含色氨酸的疏水性氨基序列（KETWWETWWTEW）和富含賴氨酸親水性結(jié)構(gòu)域（KKKKV）以及分隔2個結(jié)構(gòu)域的間隔區(qū)（WSQP）組成。Pep-1 可與肉毒桿菌神經(jīng)毒素結(jié)合進入小鼠皮膚，有效滲透到表皮和真皮；Pep-1也可與超氧化物歧化酶（SOD）融合，轉(zhuǎn)導(dǎo)到皮膚組織中，實現(xiàn)對缺血性腦損傷的有效治療。

       人工設(shè)計合成的透皮介導(dǎo)肽具有高度可定制化、無天然限制和精確控制等優(yōu)點，使其在藥物遞送和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有巨大潛力。然而在實際研發(fā)過程中，需要克服成本高、設(shè)計復(fù)雜性以及潛在的生物相容性問題等限制和不足。

       促滲作用機制

       目前關(guān)于透皮介導(dǎo)肽轉(zhuǎn)導(dǎo)載荷進入細(xì)胞的機制研究存在著諸多矛盾之處。對已經(jīng)報道的代表性透皮介導(dǎo)肽的研究發(fā)現(xiàn)，存在于它們之間的唯一共同特征是兩親性和帶正電荷。在正常生理條件下，皮膚帶負(fù)電荷，而皮膚真皮層和角質(zhì)層也分別呈現(xiàn)親水性和親脂性差異。從皮膚特性來講，兩親性和陽離子似乎也正是透皮所要求的基本條件。

       ①表面正電荷屬性推動透皮介導(dǎo)肽吸附到皮膚表面。對于透皮介導(dǎo)肽一級結(jié)構(gòu)的分析證實了表面電荷對于透皮能力的影響。就自然屬性和界面位置來看，正負(fù)電荷之間的相互作用是透皮介導(dǎo)肽進入皮膚的第一步，正負(fù)電荷相吸作用推動了透皮介導(dǎo)肽吸附到皮膚表面上來，且陽離子特性越強，接觸面積越大，吸附性也越強。

       ②透皮介導(dǎo)肽通過擾亂細(xì)胞間脂質(zhì)結(jié)構(gòu)或角蛋白結(jié)構(gòu)透過角質(zhì)層。角質(zhì)層中不管是細(xì)胞內(nèi)傳遞路徑還是細(xì)胞間傳遞路徑，由于存在著層間傳遞，即使親水性物質(zhì)也必須通過下一層的細(xì)胞間脂質(zhì)，才能到達細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)胞間脂質(zhì)實際上就成為外來物質(zhì)傳遞的主要限速結(jié)構(gòu)。 目前，大多數(shù)研究傾向于透皮介導(dǎo)肽通過擾亂細(xì)胞間脂質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)而通過角質(zhì)層，也有一些研究認(rèn)為，透皮介導(dǎo)肽穿過細(xì)胞間脂質(zhì)并不簡單是由于脂質(zhì)結(jié)合而導(dǎo)致的擾亂作用，而是認(rèn)為透皮介導(dǎo)肽能夠使角質(zhì)層中角蛋白構(gòu)象由β-折疊向α-螺旋轉(zhuǎn)變，從而擾亂角蛋白結(jié)構(gòu)，造成通透性。

       ③精氨酸頭部胍基主宰與真皮層細(xì)胞膜表面結(jié)合。透皮介導(dǎo)肽及其載荷穿過角質(zhì)層后，在 真皮層細(xì)胞中，共軛的載體肽和載荷藥物穿過脂質(zhì)細(xì)胞膜進入細(xì)胞質(zhì)中，同角質(zhì)層中細(xì)胞間脂質(zhì)一樣，膜脂結(jié)構(gòu)也是入胞的主要障礙，精氨酸的胍基頭部這時起到了重要作用。陽離子透皮介導(dǎo)肽中的精氨酸頭部胍基是入胞的關(guān)鍵功能組分，細(xì)胞膜表面硫酸多糖在細(xì)胞表面形成電負(fù)性池，吸引帶正電荷的精氨酸頭部胍基，兩者緊密結(jié)合；同時細(xì)胞膜的磷酸基團、硫酸基團與精氨酸殘基的頭部胍基基團形成配位氫鍵，促使胍基進一步結(jié)合到細(xì)胞膜表面。

       ④胞吞作用使外界物質(zhì)進入細(xì)胞內(nèi)。多數(shù)研究者傾向于真皮層細(xì)胞通過胞吞作用攝取透皮介導(dǎo)肽及其載荷進入細(xì)胞內(nèi)，而且受濃度、載荷種類、細(xì)胞類型等影響，對于陽離子透皮介導(dǎo)肽，巨細(xì)胞胞飲為主要細(xì)胞攝取形式。

       ⑤細(xì)胞退出機制實現(xiàn)透皮介導(dǎo)肽及其載荷的逐層傳遞，最終到達真皮層。如果外界物質(zhì)是通過進入細(xì)胞而實現(xiàn)傳遞，那就必然存在一個物質(zhì)從細(xì)胞退出的機制，否則無法在真皮層以及血液中得到想要傳遞的物質(zhì)。研究已經(jīng)證實，細(xì)胞退出機制在透皮介導(dǎo)肽攜帶載荷傳遞中的作用。

       ⑥皮膚物理屬性等其它調(diào)控因素對于透皮的影響。除去細(xì)胞間途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑外，透皮介導(dǎo)肽傳遞的第3條途徑皮膚附屬器官通道對于傳遞機制也會產(chǎn)生一定的影響。一般認(rèn)為皮膚厚度可能會影響透皮吸收效率，而對于膚厚度與經(jīng)皮吸收之間的研究發(fā)現(xiàn)，皮膚厚度與不同動物經(jīng)皮吸收能力之間并沒有直接的關(guān)聯(lián)，α-促黑激素（α-MSH）能夠透過人和小鼠腹部皮膚，促進毛發(fā)和皮膚變黑，卻難以透過大鼠皮膚，而人在某些部位的皮膚厚度與大鼠相當(dāng)。由此表明不同透皮化合物對不同實驗動物在經(jīng)皮吸收方面存在著巨大的差異，很難由一種動物模型推斷出另一種動物的吸收特性。

       參考資料

       [1]龔魁杰,石愛民,劉紅芝,等.透皮介導(dǎo)肽及其經(jīng)皮吸收機制研究進展[J].中國食品學(xué)報,2017,17(04):165-173.

       [2]黃鈺卿,王宇岐,丁平田,等.透皮介導(dǎo)肽的研究進展[J].藥物評價研究,2024,47(07):1653-1668.

       作者簡介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證