口服生物可利用的、可逆的FXIa抑制劑作為新型抗凝血藥物，具有較高的安全性和效果，特別適合慢性血栓性疾病的治療。拜耳公司公開了開發(fā)口服FXIa抑制劑Asundexian的優(yōu)化過程。該化合物首先通過基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計獲得初始Hit化合物3經(jīng)過替代高能量水分子、優(yōu)化親和力、預(yù)組織構(gòu)象、填充額外親脂口袋、減少代謝軟點、掩蓋極性氫等方式調(diào)整親和力和每日一次口服給藥所需的DMPK，最終獲得臨床候選化合物Asundexian。Asundexian目前已進(jìn)入多個III期臨床試驗，用以治療房顫和缺血性卒中，展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本文梳理了Asundexian的設(shè)計策略與優(yōu)化路線，可為類似項目結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供寶貴經(jīng)驗。

       心腦血管疾病的發(fā)病率不斷上升，臨床上對藥物的需求也日益增長。相較于現(xiàn)有藥物，F(xiàn)XIa抑制劑能夠通過靶向作用體內(nèi)的凝血途徑，從而避免對止血功能產(chǎn)生影響，可是更為安全有效的抗凝血劑。

       根據(jù)中國藥物臨床試驗登記與信息公示平臺官網(wǎng)公示，拜耳（Bayer）已登記兩項關(guān)于口服FXIa抑制劑Asundexian（BAY2433334）的國際多中心（含中國）III期臨床研究，針對的適應(yīng)癥分別為預(yù)防房顫患者卒中或體循環(huán)栓塞，以及預(yù)防患有急性非心源性栓塞型缺血性腦卒中或高風(fēng)險短暫性腦缺血發(fā)作患者的缺血性腦卒中。

       近日J(rèn)MC報道了有關(guān)Asundexian發(fā)現(xiàn)工作。研究人員通過基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計確定了微摩爾級別的Hit。繼續(xù)優(yōu)化平衡效價和吸收，改善代謝穩(wěn)定性、細(xì)胞色素P450相互作用譜和臨床DMPK，驗證了其藥理學(xué)功能。整體設(shè)計方案貫穿了化合物構(gòu)象行為和官能團(tuán)行為的設(shè)計思想，保證官能團(tuán)與目標(biāo)蛋白的強相互作用，剛化FXIa預(yù)組織構(gòu)象保持重要氫鍵作用，優(yōu)化合適的低極性表面，實現(xiàn)效價和吸收的平衡。

       設(shè)計和優(yōu)化過程總結(jié)如下

       part .01

       Hit發(fā)現(xiàn)

       研究人員最初對Bayer AG內(nèi)部包含430萬種化合物的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行高通量篩選未得到有效Hit，轉(zhuǎn)而采用SBDD方法進(jìn)行從頭設(shè)計可逆，靶向活性位點的化合物。

       受BMS2007年發(fā)表的四氮唑化合物啟發(fā)，定義口服FXIa抑制劑重要相互作用：

       （1）親脂性芳香基團(tuán)（最好是氯芳基取代基）占據(jù)S1口袋；

       （2）羰基占據(jù)氧陰離子孔（OAH），并可與Lys192和Gly193的主鏈NH基團(tuán)形成一個或兩個強氫鍵；

       （3）強氫鍵受體作用于S1口袋邊緣Gly216的主鏈NH；

       （4）強氫鍵供體（如NH基團(tuán)）作用于捕獲水分子（位于Leu39和Ser195之間）；

       （5）Linker攜帶中性或酸性官能團(tuán)，能夠接受兩個氫鍵（來自Tyr143和另一捕獲水分子）

       （6）由于這個設(shè)計概念涉及相對較多的極性官能團(tuán)，期望使用親脂性Linker連接。

       以雜芳香核為中心進(jìn)行枚舉，經(jīng)過對接、能量評價，獲得化合物3，具有微摩爾效價，對其他絲氨酸蛋白酶（如凝血酶、FXa、胰蛋白酶）具有良好的選擇性（所有IC50均大于50μM）。

       part .02

       Lead尋找

       使用表征配體結(jié)合口袋內(nèi)容納估計結(jié)構(gòu)和能量的分子動力學(xué)方法watermap，計算底物結(jié)合口袋中的水分子的作用能和熵變，尋找能量貢獻(xiàn)位點（S1>S2>S1`>S1邊緣>EBP）。

       為了提高化合物3的效力，鄰位取代P1氯芳基額外填充EBP和S1`。并通過預(yù)組織吡啶酮和氯芳基環(huán)之間的二面角來進(jìn)一步提高藥效。研究人員提出，這個由FXIa共晶的3的這個二面角理想角度為-66°。目標(biāo)設(shè)定為探索由一個或兩個非氫原子組成的相對較小的，極性不太強的取代基占據(jù)EBP，經(jīng)枚舉對接排序，結(jié)果表明o-CN為局部最優(yōu)。

       S1`口袋的能量不利的水分子，以親脂性基團(tuán)取代，化合物效力增加了10倍以上。

       探索C5取代基，旨在與主鏈Gly216形成相互作用，枚舉各種取代基與EBP組合，計算排序。Cl取代物通過構(gòu)象限制效價提高6倍。通過引入OCH3提供與Gly216主鏈形成氫鍵，效價提高29倍?；衔?4，F(xiàn)XIa效價IC50為2nM，clogD7.5為1.6，性質(zhì)良好，接下來優(yōu)化人血漿抗凝活性。

       進(jìn)一步探索P1`基團(tuán)，引入甲氧乙基取代基，醚氧與Ser195捕獲水分子的額外氫鍵作用，抗凝血活性有所增加，整合入環(huán)醚，提高了溶解度。在這個過程中化合物34被認(rèn)為是綜合性質(zhì)最 好的化合物，被用于首次人體研究評估，然而，化合物34口服暴露量和人類半衰期的不達(dá)預(yù)期。推測需要修改其羧酸部分。

       part .03

       P2`的調(diào)整

       由于中心酰胺鍵NH與Leu39通過水介導(dǎo)形成的相互作用必不可少，必須保持此苯胺結(jié)構(gòu)；為了避免潛在毒 性，需使用Ames陰性苯胺；并保證同時與His38、Arg37D和Tyr143形成氫鍵。枚舉一系列非酸性P2`基團(tuán)。用FEP+計算結(jié)合自由能，化合物43二氫吲唑啉酮滿足條件，但tPSA高，Caco-2實驗中幾乎沒有滲透性，并且顯示高外排。

       將二氫吲唑啉酮改成氨基甲?；ㄆ渲蠳H2一個氫參與分子內(nèi)氫鍵，掩蓋極性）或其他非酸性P2`衍生物提高了滲透性，但大鼠體內(nèi)清除率較高，需要改善。

       part .04

       再次調(diào)整P1`調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)定性

       研究分子在大鼠和人肝細(xì)胞中的代謝發(fā)現(xiàn)，P1`是代謝軟點，采用保持P1`小，減少代謝位點的策略優(yōu)化得到乙基取代。

       part .05

       再次調(diào)整EBP提升效力

       根據(jù)體內(nèi)藥理學(xué)對單一立體異構(gòu)體的效價目標(biāo)為個位數(shù)納摩爾級別，aPTT實驗中延長血漿凝固時間，實驗體積下，EC50<50μM。調(diào)節(jié)理化性質(zhì)放棄了P2`羧酸，P1`烷基醚的擴展，再次調(diào)整效力的空間只剩EBP。

       選取五元雜芳基進(jìn)行探索，希望通過調(diào)整C5，N4調(diào)整提高效力維持滲透。枚舉組合，計算FEP+排序。測試后分析SAR，得出五元雜環(huán)以鹵素原子取代后，鹵素與Gly218主鏈NH形成氫鍵；雜芳環(huán)上鄰三唑提升氫鍵強度。EBP最 好的片段為1，2，3-三氮唑-1-基。

       part.06

       P2`再評價和candidate選擇

       確定氯、三氟甲基或二氟甲基取代基的三唑為EBP首選，甲基或乙基小烷基是P1`的有利選項之后，再次優(yōu)化P2`。嘗試了不同取代考量CYP3A4抑制、Ames測試、外排、代謝穩(wěn)定性等原因確定F取代的氨基甲酰基為最優(yōu)片段。

       最后的修飾周期設(shè)計了3*3矩陣：CHF2、CF3、Cl；Me、Et、n-Pr；確定80（Asundexian）為候選化合物。

       臨床候選物Asundexian的結(jié)合特征

       P1氯芳基與Tyr228形成π-陽離子相互作用，取代能量不利的水分子；

       中心酰胺NH形成水介導(dǎo)的氫鍵；

       末端P2酰胺一個氫與Tyr143的酚羥基之間形成氫鍵；酰胺羰基與Arg37D形成一個氫鍵，與His414形成水介導(dǎo)的氫鍵；

       取代三氮唑的一個氟與Gly218形成氫鍵；

       乙基指向S1 '口袋形成親脂作用；

       甲氧基氧和Gly216之間形成氫鍵；

       吡啶酮羰基與OAH中Gly193, Ser195形成氫鍵。

       對Asundexian的深入評價顯示，在緩沖液中測試IC50=1.0 nM和在人血漿中接觸激活后測試IC50=0.14 μM，對FXIa具有有效的可逆抑制作用。

       Asundexian抑制FXIa最接近的同源物人血漿鉀激肽，緩沖液中的IC50值為6.7 nM，人血漿中的IC50值為1.23 μM。

       Asundexian對與止血系統(tǒng)相關(guān)的絲氨酸蛋白酶，包括FVIIa、FIXa、FXa、FXIIa、凝血酶、尿激酶、組織纖溶酶原激活劑、活化蛋白C或纖溶蛋白，以及其他與口服給藥途徑相關(guān)的潛在重要蛋白酶，如胰蛋白酶、凝乳胰蛋白酶和鈣脫蛋白（凝乳胰蛋白酶C），顯示出超過1000倍的良好選擇性。

       在人血漿中加入Asundexian后，aPTT實驗的凝血時間延長，EC150為0.20 μM（以最終檢測體積150 μL計算），以血漿濃度（50 μL）計算EC150為0.61 μM。家兔、犬、小型豬和豚鼠血漿樣品的aPTT均有延長，EC150值分別為4.5、4.8、1.5和6.4 μM，而小鼠和大鼠血漿樣品（EC150>30 μM）的凝血時間未見延長。

       在體內(nèi)，通過多種血栓形成模型測定了Asundexian的抗血栓作用。在FeCl2誘導(dǎo)的兔頸動脈損傷模型中，與對照動物相比，劑量依賴性地減少血栓重量，在最高劑量下以預(yù)防方式靜脈注射，幾乎完全減少了血栓重量，ED50為380 mg/L。而在同時進(jìn)行的耳出血時間測量中，未觀察到影響。當(dāng)Asundexian與抗血小板藥物(阿司匹林和替格 瑞洛)聯(lián)用時，這種不增加出血時間的強抗血栓療效得到了證實，并得到了靜脈血管（FeCl2誘導(dǎo)的家兔頸靜脈損傷）和動靜脈分流模型研究的支持。當(dāng)以PEG/乙醇/水溶液的10和30 mg/kg劑量家兔口服給藥時，分別使血栓重量減少30%和91%。

       對于早期化合物，可逆的和時間依賴性的CYP抑制是一個至關(guān)重要的參數(shù)。Asundexian對CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C19、CYP2E1、CYP2J2和CYP3A4活性的影響不超過最高測試濃度（IC50>41 μM）。對CYP2C8（IC50=3.6 μM）、CYP2C9（IC50=17 μM）、CYP1A1（IC50=13 μM）和CYP2D6（IC50=19 μM）有較弱抑制。

       此外，Asundexian與NADPH補充的人肝微粒體預(yù)孵育（30 min）后，僅對CYP3A4的抑制效力略有增加（IC50=17 μM）。在人肝細(xì)胞中進(jìn)一步研究，未觀察到對CYP3A4抑制劑量依賴性。

       在Caco-2細(xì)胞腸吸收模型中，Asundexian表現(xiàn)出高通透性[Papp(A?B)=143 nm/s]和中等流出比7。使用平衡透析法3H標(biāo)記原藥測定血漿中游離Asundexian，在大鼠（2.4%）、猴（6.2%）和人（6.4%）血漿中游離中等，犬（10%）和家兔（14%）血漿中游離率較高。

       雄性Wistar大鼠和雌性beagle犬經(jīng)靜脈（0.3 mg/kg）和口服（1.0 mg/kg）給藥后，Asundexian顯示低清除率（大鼠0.46 L/h/kg，犬0.19 L/h/kg），高分布體積（大鼠0.76 L/kg，犬1.80 L/kg），中高生物利用度（大鼠60%，犬97%）。

       part

       臨床I期實驗結(jié)果

       Asundexian顯示出一致的PK/PD關(guān)系，藥效學(xué)參數(shù)(如抗凝血活性（aPTT）和FXIa抑制活性呈劑量依賴性變化，而出血時間在所有劑量組中一致，與安慰劑相似。沒有觀察到臨床相關(guān)的出血事件或?qū)Τ鲅獣r間的影響。

       在單劑量和多劑量人體藥代動力學(xué)研究中，Asundexian暴露量呈劑量依賴性，口服生物利用度高，經(jīng)速釋片給藥后，幾何平均消除半衰期約為14 - 17小時。因此，Asundexian是一種有潛力日給藥一次的臨床候選化合物，在房顫患者PACIFICAF18（NCT04218266）、非心源性卒中患者PACIFIC-STROKE19（NCT04304508）和急性心肌梗死患者PACIFIC-AMI 20（NCT04304534）三個II期劑量研究中研究了其有效性和安全性。

       目前，正在進(jìn)行房顫患者以及非心源性缺血性卒中或高風(fēng)險瞬時缺血性發(fā)作患者中預(yù)防卒兩項OCEANIC III期研究，涉及多達(dá)30,000例患者（OCEANIC-AF和OCEANIC-STROKE），以驗證Asundexian的有效性和安全性。美國食品和藥物管理局（FDA）已批準(zhǔn)Asundexian作為非心臟栓塞性缺血性中風(fēng)患者二級預(yù)防的潛在治療藥物的快速通道資格。